نیاز به محیط اختصاصی باکتری

هدف تهیه یک محیط کشت است که از نظر فیزیولوژیکی برای باکتریهای مطلوب باشد که از نظر تجربی برای بسیاری از اهداف تغذیه ای، متابولیکی و فیزیولوژیکی مفید بوده و برای جابجایی گسترده آن به اندازه کافی مناسب باشد. به طور خاص یک محیط با خصوصیات زیر مورد نظر می باشد: (۱) غلظت هر یک از عناصر اصلی مواد مغذی محیط کشت (فسفر، نیتروژن، کربن و گوگرد) باید بطور مستقل قابل تنظیم باشد و باید با ترکیب آن در پروتوپلاسم باکتریایی در مقادیر متناسب تنظیم شود. به منظور تسهیل برچسب زدن ایزوتوپی. (ب) نرخ رشدی که توسط محیط حمایت می شود باید حداقل به همان میزان سریع باشد که توسط هر حداقل شناخته شده پشتیبانی شود. (III) محیط کشت باید از رشد تا تراکم سلولی که برای اندازه گیری های بیوشیمیایی مفید است پشتیبانی کند. (IV) باید به راحتی ساخته شود و ارزان باشد. (v) باید پایدار باشد و ترجیحاً قادر به ذخیره سازی به صورت غلیظ باشد. (vi) باید نرخ رشد قابل تکرار را بدهد. (vii) باید اندازه گیری جذب را مجاز کند. (viii) رشد سلولها باید به طور نامحدود حمایت شود و نباید به حضور پرماجرا ریز مغذی ها بستگی داشته باشد و (ix) غلظت یون هیدروژن باید به اندازه کافی بافر شود.

محیط کشت MOPS

محیط کشت MOPS که در اینجا شرح داده شده است تمام این مشخصات را برآورده می کند چند نظر در مورد ویژگی های فردی محیط به ترتیب است. سیستم بافر pH از بسیاری جهات انتخاب یک بافر مناسب مسئله اصلی در تدوین یک ماده مصنوعی برای مطالعات بیوشیمیایی روی باکتریها یا سایر میکروارگانیسم ها است. تمایل فیزیولوژیست برای دستیابی به تراکم سلولی بالا در محیط کشت تقاضای سنگین را بر روی ظرفیت بافر pH محیط قرار می دهد و مستلزم آن است که غلظت یونهای خاص به ویژه Fe2 3+ در حد pH محلول در حد محلول انحلال باشد. نمک های فسفات به دلیل داشتن pK مطلوب انتخابی کلاسیک برای بافر بوده و به دلیل داشتن یون فسفات به عنوان یک کلات فلزی یک مخزن محلول مفید یون های فلزی و همچنین این محیط کشت انتروباکتری یک منبع پرماجرا از عناصر مختلف مورد نیاز در مقادیر کمیاب را فراهم می کند. متأسفانه سودمندی برچسب زدن ۳۲p [P04] در زیست شناسی مولکولی مستلزم آن است که غلظت فسفات در زیر یک سطح که در آن یک بافر یون هیدروژن موثر است کاهش یابد. جایگزین معمول Tris بوده است اما برای بسیاری از گونه ها این ماده در غلظت های بالای مورد نیاز PK نامطلوب آن در محیط کشت سمی است. MOPS یکی از سری بافرهای آلی ساخته شده توسط Good و همکارانش برای استفاده در کارهای بیولوژیکی به دلیل داشتن pK مفید (۷٫۲ در ۲۰ درجه سانتیگراد) به جای آن در محل ترینس انتخاب شده است. وعده عدم سمی بودن و نسبتاً ارزان قیمت بود. در غلظت هایی که یک بافر رضایت بخش است هیچ اثری قابل ردیابی بر رشد ندارد.

فرمولاسیون نهایی محیط انتروباکتری

فرمولاسیون انتخاب شده برای محیط کشت در نهایت (۴۰ میلی متر؛ pH متوسط اولیه ۷٫۲ در ۳۷ درجه سانتیگراد) از رشد گلوکز در کل محدوده توصیه شده از تراکم سلولی برای مطالعات حساس فیزیولوژیکی (حداکثر تا A420 2.0) با افت فقط ۰٫۲ واحد pH پشتیبانی می کند و رشد نمایی تا A420 از ۵٫۰ با افت تنها ۰٫۵ واحد pH را امکان پذیر می کند. از آنجا كه گلوكز محیط کشت اسيد ترين ریز عنصر شناخته شده براي آنزيم باكتري است محيط كيفيت هر چه مواد تركيبات آلي محيط را داشته باشد رضايت بخش است. MOPS را نمی توان به عنوان منبع کربن، نیتروژن یا گوگرد توسط S. typhimurium استفاده کرد. گونه های E. coli که مورد آزمایش قرار گرفتیم نمی توانند از MOPS به عنوان منبع کربن یا ازت استفاده کنند اما در صورت عدم وجود سولفات اضافه شده می توانند از MOPS به عنوان منبع گوگرد استفاده کنند. این استفاده توسط سطوح پایین سولفات آزاد در محیط کشت باکتری کاملاً سرکوب می شود بنابراین برچسب زدن ایزوتوپی با ۳۵S [SO ، ۲- من هیچ مشکلی را نشان نمی دهد. تنها روشی که امکان استفاده از محیط MOPS وجود ندارد رشد سولفور محدود شده از E. coli است. برای این منظور تنها Tris را می توان با MOPS جایگزین کرد به شرط اینکه pH با دقت کنترل شود. MOPS یک یونیتور فلزی ضعیف است و از این رو از ویژگی مطلوبی برخوردار نیست که بعید به نظر برسد آلاینده های فلزی خارجی را به محیط کشت وارد کند. در عین حال در حفظ غلظت مناسب Fe2 3+ در pH خنثی مفید نیست. Tricine (6) باعث کلات Fe2 ‘3+ می شود و اضافه کردن مقدار کمی از این بافر آلی نه تنها یک مخزن رضایت بخش از آهن محلول در محیط عادی را فراهم می کند بلکه حتی امکان ساخت یک ماده غلیظ ۱۰ برابر را نیز برای استفاده راحت فراهم می کند. ذخیره سازی: کربن و منبع انرژی استفاده از گلوکز به عنوان محیط کشت برای رشد انتروباکتریها به حدی گسترده است که با وجود چندین ویژگی غیرمعمول متابولیسم آن توسط تخمیر هوازی به عنوان یک کربن استاندارد و منبع انرژی انتخاب شد و محیط MOPS تا حد زیادی با آن توسعه یافت. ما دو غلظت مشخص کردیم. بالاتر از لحاظ تئوری قادر به حمایت از رشد به تراکم سلولی ۱٫۵ میلی گرم (وزن خشک) در میلی لیتر است که پنج برابر بالاتر از حداکثر است (Al20 = 2.0 ؛ ۰٫۲۸۶ میلی گرم [وزن خشک] / میلی لیتر) که برای مطالعات فیزیولوژیکی توصیه می شود. این سطح برای سرعت رشد اشباع است. سطح پایین تر برای تهیه محیط کشت های یک شبه انتخاب شد. از رشد نمایی تا تراکم نوری ۱٫۰۵ (وزن ۱۵/۰ میلی گرم از سلول / میلی لیتر) پشتیبانی می کند. قبل از شروع اندازه گیری سلولهای حاصل از این كشتهای گلوكلوسلوموله تلقیح مناسب برای بیشتر آزمایشات است ، تا زمانی كه دوره رشد مناسب مجاز باشد (ترجیحاً سه نسل). از طرف دیگر در بسیاری از موارد ترجیح می شود محیط کشت های سبکی با سلولهایی که در حال حاضر در معرض رشد قرار دارند تلقیح شود. اندازه تلقیح را می توان به گونه ای تنظیم کرد که در یک زمان مشخص در روز بعد کشت در تراکم مورد نظر قرار گیرد.

مواد مغذی در کشت انتروباکتری ها مواد مغذی فسفات و سولفات در محیط کشت جدید تنظیم شد مانند گلوکز در مقادیر معادل یک محصول سلولی ۱٫۵۰ میلی گرم (وزن خشک) در میلی لیتر (A520 = 10.5) که از مطالعات تغذیه ای با S. typhimurium NT1 محاسبه شده است. برای همه اهداف عملی این غلظتها با توجه به نرخ رشد اشباع می شوند. همچنین سطح سولفات برای سرکوب تخریب MOPS توسط E. coli کافی است. سطح منیزیم موجود در محیط کشت باید در غلظت سه برابر بالاتر تنظیم می شد زیرا به اندازه کافی مشخص نبود که سطح معادل یک محصول سلولی ۱٫۵۰ میلی گرم در میلی لیتر از لحاظ سرعت رشد اشباع می شود. اگرچه برای S. typhimurium مشخص شده است. ممکن است سطح این مؤلفه ها برای کلیه اهداف عملی برای E. coli متعادل باشد. نمکهای خاص مورد استفاده (K2HPO ، K2SO ، و MgCl2) به دلیل در دسترس بودن انتخاب آنها از پتاسیم یا کلرید به عنوان یک پیشخوان و خصوصیات نسبتاً مطلوب این محیط کشت ها با توجه به پایداری، حلالیت، ظرافت و حضور آلاینده ها انتخاب شدند.

نسبت غلظت عناصر در محیط

همان ویژگی ها برای منبع نیتروژن در محیط کشت انتروباکتری انتخاب شده NH4Cl وجود دارد. حالت دوم عمداً در سطح معادل معادل سلولی ۱٫۰ میلی گرم در میلی لیتر (A420 = 7.0) تنظیم شده است به گونه ای که در صورت وجود بستر کربن اضافی کشتهای موجود در این محیط همه در همان تراکم یکسان و با فاز ثابت قرار می گیرند. همان محدودیت نیاز به آهن اضافه شده به راحتی با محیط کشت هایی مانند استات نشان داده می شود که بطور عمده توسط مسیرهای اکسیداتیو با استفاده از پروتئین های آهن متابولیزه می شوند و با استفاده از گلیسرول یا گلوکز به آسانی کمتر می شوند. با وجود بعضی از رسانه ها که حاوی غلظت بالایی از نمک های فسفات هستند (به عنوان مثال دیویس-مینگولی ، M9 و وکرمن) یک نیاز آهن کمتر به راحتی نشان داده می شود. احتمالاً به دلیل معرفی آهن به عنوان یک آلاینده پرماجرا. ما سطح آهن را در محیط MOPS در ۱۰ ثانیه در میلی متر برای محیط کشت تنظیم می کنیم زیرا برای منابع کربنی که معمولاً مانند گلوکز و گلیسرول استفاده می شود کاملا اشباع است اما هنوز قابل تشخیص نیست. برای رشد روی استات (و احتمالاً ساکینات) مقدار آهن باید پنج برابر افزایش یابد. در این سطح آهن اشباع با سرعت رشد خواهد بود و محیط فقط رنگ زرد مایل به زرد خواهد داشت (A420 = 0.012). یک دوره جایگزین برای افزایش مقدار کلات کلریدنی Tricine-isnot به دلیل محدوده بهینه غیرمترقبه غلظت آهن تحت این شرایط توصیه می شود. ما دریافته ایم که هپاتیدرات FeSO4 یک نمک مناسب برای کنترل است. مقدار کمی سولفاتدر محیط کشت باکتری ها (کمتر از ۴٪) که به سولفات عرضه شده به عنوان K2SO4 اضافه می کند تنها یک نقض جزئی از اصل ما در استفاده از منابع واحد از مواد مغذی اصلی است. در صورت نیاز به شرایط خاص FeCl2 را می توان به راحتی جایگزین کرد. ریز مغذی ها در صورت عدم وجود روشهای حساس برای تعیین نیازهای کمی از انتروباکتریها در محیط کشت برای مس، منگنز، کبالت، مولیبدن، بور و روی لازم است استراتژی متفاوتی اتخاذ شود. اجزای یک محلول ریز مغذی (ماکلیس) که برای حمایت از رشد قارچ ها تولید شده بود هرکدام از نظر سمیت به سوی گونه های انتروباکتریها مورد آزمایش قرار گرفتند. اثرات مهاری فقط در غلظت ۱۰۰۰ برابر بالاتر از محلول ماچلیس مشاهده شد. با استفاده از ایمنی می توان یک غلظت ۱۰۰ برابر کمتر برای محیط MOPS را مشخص کرد تا اطمینان حاصل شود که سلولهای باکتریایی برای این عناصر اشباع می شوند و نوسانات آزمایشگاهی به آزمایشگاه در سطح آلودگی سایر اجزای محیط (از جمله ظروف شیشه ای و آب) ناچیز خواهد بود. همانطور که گفته شد. کشف بعدی جهش یافته ای که به مکمل ریز مغذی محیط MOPS پاسخ می دهد نیاز به چنین عناصر را تأیید می کند و شمول عمدی آنها را توجیه می کند. غلظت نمک

تلاش برای بالاترین سرعت رشد و کم ترین غلظت محیط کشت

گنجاندن ۵۰ میلی مولار سدیم کلسیم در فرمول نهایی محیط کشت مورد نظر با بی میلی انجام شد. تلاش شده است که غلظت هر یک از اجزای محیط را در پایین ترین سطح سازگار با سرعت رشد مطلوب و یک محصول نظری سلول ۱٫۵۰ میلی گرم (وزن خشک) در میلی لیتر قرار داده شود. این محافظه کاری مبتنی بر تمایل به حداقل رساندن فرصت برای معرفی پرماجرا مواد تحریک کننده یا مهاری بود. هیچ نیاز شناخته شده ای از باکتری ها برای سدیم وجود ندارد و مقدار کلرید موجود در محیط موجود در مقدار کافی به نظر می رسد. هیچ نشانه ای نمی توان یافت که تحریک جزئی اما واقعی رشد با ۵۰ میلی مولار سدیم کلسیم حاصل از آلاینده ها بود. به طور آزمایشی نتیجه می گیریم که به سادگی به استحکام یونی محیط کشت کمک می کند. در صورت تمایل به استفاده از یک محیط کاملاً عاری از سدیم ، بدون شک KCl می تواند برای NaCl که به طور خودسرانه انتخاب کردیم جایگزین شود.

رشد هوازی در محیط کشت باکتری ها (گازهای محلول)

این محیط کشت با استفاده از رشد هوازی به عنوان یک راهنمای تعیین کننده تولید شده است. البته این از رشد بی هوازی پشتیبانی می کند ، اما ما تحت این شرایط هیچ اندازه گیری گسترده ای در خصوص ویژگی های آن انجام ندادیم. فلاسکهای ارلنمایر در حال چرخش که مورد استفاده قرار می گرفتیم هوادهی مناسبی را ارائه می دهند. اما دشواری پاسخگویی به نیاز اکسیژن از محیط کشت های باکتریایی با سرعت زیاد و در حال رشد کاملاً آشکار است. به همین دلیل ما در مطالعات فیزیولوژیک حد بالایی چگالی سلول را با این ماده به عنوان A420 2.0 (دقیقاً کمتر از ۰٫۳ میلی گرم از وزن خشک در میلی لیتر) تعریف کرده ایم. ما به دلیل ناراحتی آن مشکل در استانداردسازی ترکیب گاز از آزمایشگاه به آزمایشگاه احتمال معرفی آلاینده های شیمیایی به عنوان آلاینده های ناشی از گاز و مشکلات ناشی از CO2 استفاده از هوادهی اجباری (پاشش) را در نظر گرفته و رد کردیم. نیاز سلولهایی که در گلوکز در حد متوسط رشد می کنند.

کشت باکتری ایی کولای

به نظر می رسد موضوع اخیر در قلب رفتار E. coli بر رقت زیاد در محیط کشت گلوکز-MOPS قرار داشته باشد. مدت زمان تاخیر چند ساعته در این شرایط برای کلیه اهداف عملی با شامل ۱۰ میلی متر NaHCO در محیط حذف می شود. این نتیجه مطابق با گزارش های قبلی در مورد نیاز CO2 به E. coli است که از نظر هوازی در محیط گلوکز حداقل رشد می کند. مشکل با S. typhimurium NT1 حاد کمتر است و از جمله NaHCO.3 غیر ضروری به نظر می رسد. لازم به ذکر است که برای تهیه محیط کشت مناسب حداقل دو دلیل عملی وجود دارد که بخواهیم بتوانیم بدون معرفی دوره تاخیر چند سلول در میلی لیتر را رقیق کنیم. اول این تکنیک در صورت وجود دستگاه رقت اتوماتیک مداوم برای حفظ سلول ها در رشد متعادل برای دوره های طولانی مفید است و دوم پیش بینی عالی رشد سلولی باعث می شود که یک روز از قبل فرهنگ ها آماده شود و دارای نمایی باشد. سلول های فاز در یک تراکم خاص آماده در یک زمان از پیش تعیین شده روز بعد.

محیط کشت جدید باکتری

راحت ترین ویژگی محیط کشت جدید این است که می توان آن را به عنوان یک کنسانتره ۱۰ برابری تهیه کرد که در محل رقیق سازی فقط نمک فسفات و یک منبع کربن وجود دارد. برای بسیاری از محققان ، کمترین ویژگی مناسب رسانه ممکن است ضرورت افزودن مواد مغذی و ضرورت عقیم سازی فیلتر باشد. استریل کردن هر محیط کشت به وسیله اتوکلاو به دلیل دشواری در دستیابی به محصول قابل تولید مجدد توصیه نمی شود. اتوکلاو کردن این محیط خاص به دلیل عدم مقاومت گرمای بافر امکان پذیر نیست. عقیم سازی فیلتر. با این حال به راحتی با در دسترس بودن فیلترهای غشایی از پیش تعیین شده (و نگهدارنده) انجام می شود که این نیاز یک مورد تحمل محسوب نمی شود. فقط محیط غلیظ نیاز به استریل فیلتر دارد. آب مقطر اتوکلاو شده به طور معمول برای تهیه محیط مورد استفاده قرار می گیرد. مراقبت های لازم برای تهیه این محیط با توجه به اهمیت این جنبه از مطالعات فیزیولوژیکی بسیار ناچیز است.