محیط کشت میکروبی

مقدمه:

محیط کشت (Growth medium) محیط دارای مایع یا ژل می ‌باشد که به منظور رشد دادن میکروب‌ها، یاخته‌ها یا حتی گیاهان کوچک مورد استفاده قرار می‌گیرد. محیط‌های کشت به طور معمول شامل دو دسته هستند:

محیط کشت سلولی(cell culture):  که در آن از یاخته‌های ویژه‌ای استفاده می‌نمایند که از گیاهان و حیوان‌ها به دست آمده‌اند.

کشت میکروبیولوژی (microbiological culture): که به ویژه به منظور رشد دادن میکروب‌ها (شامل باکتری ها، قارچ ها و …) استفاده می‌گردد، از رایج ترین انواع کشت میکروبیولوژی می‌توان به نوترینت آگار و نوترینت براث اشاره نمود.

 

محیط کشت میکروبی:

محیط کشت ، محیط مایع یا جامدی است که به منظور کمک به رشد میکروارگانیزم یا سلول ها طراحی می شود . این محیط ها حاوی منبع کربن ونیتروژن مشخص و عناصر ضروری و ویتامین های مورد نیاز میکروب می باشد.

 

 انواع محیطهای کشت:

محیطهای کشت را از نظر ترکیب شیمیایی و دارا بودن مواد غذائی یا مواد باز دارنده می‏توان به چند دسته تقسیم کرد .

۱محیط کشت انتخابی (Selective) :

این محیط ها برای جدا کردن یک یا دسته‏ای از میکروارگانیسم‏ها بکار می‏روند و به علت دارا بودن مواد بازدارنده، از رشد میکروارگانیسم‏های ناخواسته جلوگیری می‏کنند مانند محیط برد بارکر جهت جدا کردن استافیلوکوکوس اورئوس و یا محیط S.S برای سالمونلا و شیگلاو یا محیط دارای نمکهای صفراوی برای جدا کردن کلی فرمها .

این محیط ها برای رشد باکتری های مطلوب بهینه شده اند . در این محیط ها تنها باکتری های مورد نظر رشد می یابند . برای مثال اگر یک ارگانیزم به آنتی بیوتیک خاصی مثل آمپی سیلین یا تتراسیکلین مقاوم باشد میتوان این آنتی بیوتیک را به محیط کشت اضافه نمود ، در این صورت سایر سلول های حساس به این آنتی بیوتیک قادر به رشد نخواهند بود

 

۲محیطهای کشت غنی کننده (Enrichment) :

این محیط ها معمولا در مواردی به کار می‏روند که تعداد میکروارگانیسم مورد جستجو در نمونه غذائی کم بوده و یا به علت وجود زیاد میکروارگانیسم‏های دیگر جدا کردن آن با اشکال مواجه است.این محیطها با ترکیب خاص خود از نظر pH و مواد غذائی امکان رشد برای میکروارگانیسم مورد نظر را فراهم می‏کند،مانند محیط گوشت پخته برای جدا کردن استافیلوکوکوس اورئوس . این محیط شامل نیازهای غذایی پیچیده مورد نیاز برای رشد میکروارگانیزم می باشد .

بنا بر تعزیف دیگر اگر به محیط کشت کامل موادی نظیر خون یا سرم به میزان ۵ یا ۱۰ درصد اضافه کنیم محیط کشت غنی بدست می اید که میتوان به محیط کشت بلاد اگار و محیط کشت شکلات اگار اشاره نمود.

 

۳محیط های کشت افتراتی (جدا کننده) (Differential)

محیط هایی هستند که میکروارگانیسم‏های مختلف در آن ویژگیهای خاص خود را نشان می‏دهند , مانند محیط های خون دار که در آن نمونه‏های همولیتیک و غیر همولیتیک از هم جدا می‏شوند . و محیط مک کانکی آگار که در آن کلی فرمهای تخمیر کننده لاکتوز پرگنه‏های قرمز می‏دهند . در حالی که باکتریهای روده‏ای که قادر به تخمیر لاکتوز نیستند مانند سالمونلا پرگنه‏های بی رنگ به وجود می‏آورند .

 

مک کانکی آگار نوعی محیط افتراقی جامد برای متمایز کردن جمعیت زیادی ازمیکروبها است. این محیط اهمیت کاربردی زیادی در شناسایی تخمیرکننده های لاکتوز، پاتوژن های روده ای گرم منفی و جلوگیری ازرشد باکتریهای گرم مثبت دارد. کلنی باکتری های تخمیرکننده لاکتوز،محیط را به رنگ قرمز درمی آورند.رنگ قرمز درنتیجه ایجاد محیط اسیدی بوسیله تخمیر کننده های لاکتوز شکل می گیرد.ارگانیسم هایی که نمی توانند لاکتوز را تخمیر کنند، سبب تغییر رنگ نمی شوند.

 

 

ایوزین متیلن بلو آکار نوعی محیط کشت افتراقی است که برای تشخیص و جداسازی باکتری های میله ای روده ای کرم منفی استفاده می شود. همجنین ایوزین متیلن بلو آکار مانع از رشد باکتری های کرم مثبت می شود. مبنای افتراق در این محیط بکارکیری دو رنک شاخص یعنی ایوزین و متیلن بلو‘است که متمایزکننده تخمیرکننده های لاکتوز ازارکانیسمهای فاقد توانایی تخمیر لاکتوز می باشد. در این محیط باکتری های تخمیر کننده لاکتوز دارای کلنی هایی بامرکز تیره هاشیه ای شفاف خواهند بود در حالیکه ارکانیسم هایی که نمیتوانند لاکتوز را تخمیرکنند‘ کلنی های کاملا بی رنک خواهند داشت.

 

۴محیط کشت کامل یا عمومی :

مانند محیط کشت نوترینت اگار (nutrient agar) یا نوترینت براث(nutrient broth)  و این محیط ها حاوی کلیه مواد لازم برای رشد باکتری ها هستند و فاقد مواد ضد میکروبی اند .

 

۵محیط کشت اختصاصی:

در این محیط فقط یکسری باکتری های خاص می توانند رشد کنند و از رشد باکتریهای دیگر جلوگیری می شود

مانند محیط کشت مانیتول اگار که استاف اورئوس بیماریزا در ان رشد می کند و یا محیط کشت سالمونلا- شیگلا که برای جدا سازی باکتریهای فوق از انترو باکتریاسه به کار می رود

استاف (stoph) شامل:

۱- چاپمن استون اگار(c.s.a)

۲- مانیتول سالت اگار(m.s.a)

۳- برد پارکر

 

۶محیط کشت انتقالی:

برای جلوگیری از ازبین رفتن مقداری از میکرو ارگانیسم های موجود در نمونه ای که مدتی طول میکشد تا از محل گرفتن نمونه به ازمایشگاه برسد بکار می رود مثل محیط استوارت(stuart)

 

 

Agar : آگار یک پلی ساکاریدی است که از دو جزء ساخته شده است :

  • آگاروز agarose
  • آگاروپکتین agaropectin

آگارز یک پلی ساکارید خطی است که از بتا دی گالاکتوز و ۳و۶ انهیدرو آلفا ال گالاکتوز تشکیل شده است.

Beta-D-galactose + 3-6anhydro-alpha-L-galactose =agarose

آگاروپکتین یک پلیمر اسیدی است . واحدهای آگاروپکتین مانند آگارز است با این تفاوت که در برخی از جایگاهها گروههای سولفات ، متیل و پیرویک اسید جایگزین شده است .

آگار در دمای ۳۰-۴۰ درجه سانتیگراد به فرم ژل و در دمای ۹۰-۹۵ درجه به حالت سل درمی آید . آگارز در ایجاد حلت ژل در آگار نقش دارد .

آگار برای جامد کردن محیط های کشت استفاده می شود و با سایر ترکیبات موجود مانند عصاره گوشت ، پپتون ، پروتئین ها ، قند ، پیگمان ها ، معرف ها ، بازدارنده ها و … واکنش نمی دهد . حتی پس از اتوکلاو نیز تغییر ساختار یا رنگ نمی دهد . علاوه بر اینها ارگانیزم ها قادر به استفاده از آگار به عنوان منبع انرژی نیستند .

 

Mannitol Salt Agar:

این محیط یک محیط کشت انتخابی – افتراقی است ، حاوی ۵/۷ % نمک ، قند مانیتول و معرف PH فنل رد می باشد . غلظت بالای نمک آن عامل انتخابی شدن محیط و عدم رشد بسیاری از باکتری ها می گردد .

اعضای استافیلوکوک قادر به رشد در این محیط اند . S.aureus علاوه بر رشد میتواند با تخمیر مانیتول تولید اسید کند که باعث کاهش PH می شود . در PH اسیدی فنل رد از قرمز به زرد تغییر رنگ می دهد .

استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس و ساپروفیتیکوس قادر به تولید اسید نیستند ، پس کلنی های قرمز تشکیل می دهند . این امر سبب افتراق اورئوس از ساپروفیتیکوس و اپیدرمیدیس می شود .

 

osin Methylene Blue Agar:

یک محیط انتخابی – افتراقی حاوی مواد زیر است :

  • پروتئین
  • بافر
  • متیلن بلو
  • ائوزین
  • کربوهیدرات های سوکروز و لاکتوز

رنگ های ائوزین و متیلن بلو مانع از رشد باکتری های گرم + شده و به باکتری های گرم – اجازه رشد می دهند . لاکتوز و سوکروز منبع کربن اند و باکتری ها بر اساس توانایی تخمیر و عدم تخمیر لاکتوز از هم جدا می شوند . (سوکرز منبع کربن برای باکتری هاییست که لاکتوز را تخمیر نمی کنند ).

لاکتوز + (مثبت) ها کلنی تیره و لاکتوز – (منفی) ها کلنی شفاف تولید می کنند .

 

Mac Conkey Agar:

این محیط ، یک محیط انتخابی – افتراقی است که سبب رشد انتروباکتریاسه و باکتری گرم – و افتراق لاکتوز + ها از لاکتوز – ها می شود . حاوی مواد زیر است :

  • پروتئین
  • نمک صفراوی
  • کلرید سدیم
  • لاکتوز
  • کریستال ویوله
  • قرمز خنثی

 

عمل انتخابی محیط مربوط است به کریستال ویوله و نمک صفراوی که مانع رشد گرم + ها می شوند. آنها که لاکتوز + اند به رنگ قرمز صورتی اند که ناشی از تولید اسید از تخمیر لاکتوز و جذب آن توسط نوترال رد و بدنبال آن تغییر رنگ معرف به قرمز می باشد. لاکتوز – ها کلنی بی رنگ ایجاد می کنند .

 

Triple Sugar Iron Agar ( TSI ):

این محیط برای شناسایی باسیل گرم – بر اساس توانایی تخمیر لاکتوز ، گلوکز و سوکروز و تولید SH2 می باشد . محیط حاوی مواد زیر است :

  • ۱/۰% گلوکز ، ۱% لاکتوز ، ۱% سوکروز
  • منبع سولفور
  • کلرید سدیم
  • پروتئین
  • معرف SH2
  • فنل رد

 

تخمیر قندها توسط میکروارگانیزم همراه با تغییر رنگ است .

باکتری تخمیر کننده گلوکز مقادیر فراوانی از اسید را تولید می کند و رنگ محیط را زرد رنگ می کند . مواد قلیایی نیز در اثر دکربوکسیلاسیون اکسیداتیو پپتون تولید می شود . این مواد قلیایی مقدار کم اسید تولید شده در سطح را که در اثر تنفس ایجاد شده خنثی می کند ، اما نمی تواند مقدار فراوان اسید ته لوله را خنثی کند . بنابراین بالای لوله قرمز و ته آن زرد است  (K/A).

باکتری هایی که علاوه بر گلوکز می توانند لاکتوز و سوکروز را نیز تخمیر و تولید اسید کنند سبب زرد شدن کل لوله می شوند .( مقدار اسید تولیدی زیاد است ) (A/A).

عدم تغییر رنگ محیط نشاندهنده عدم تخمیر قندهاست که در این صورت احتمالا باکتری باسیل روده ای نیست (K/K).

تولید گاز همراه با ایجاد ترک و حباب در محیط است . SH2 در نتیجه احیای تیوسولفات سدیم است. این گاز با سولفات آمونیوم فریک محیط ترکیب شده و رسوب سیاهی را ایجاد می کند .

KIA (کلیگر ایرون آگار) مشابه TSI است با این تفاوت که فاقد سوکروز می باشد.

آگارآسپارژین براثآزاید دکستروز براثATP AgarATP Broth
B12 اینوکالوم براثB12 کالچر آگارB12آمیزترانسپورتاسید براث
بایل اسکولین آگاربیف اکستراکت آگاربیف اکستراکت پودربیرد پارکر آگارباسیلیوس سیریوس آگار
بریلیانتگرین آگار مودیفایدبرین هارت اینفیوژن براثبرین هارت اینفیوژن آگاربلاد آگاربیسموت سولفیت آگار
بروموکروزول پارپل آزاید براثبروسلا براثبروسلا براثبروسلا آگاربریلیانت گرین بایل براث
کلرامفنیکلیست گلوکز آگارچاپمن استون آگارسیتریماید آگارکری بلیر مدیومکامپیلو باکتر آگار
Dnase Test AgarC.L.E.D AgarCzapekdox Agar     کوکد میتکالومبیا بلاد آگار
DTM Mediumدکستروز آگاردیوکسی کولات سیترات آگاردیوکسی کولات لاکتوزدیوکسی کولات آگار
Eugonic LTاندو آگارEMB Agarای سی براثدکستروز تریپتون براث
KF Streptococcal Agarهکتون اینتریک آگارژیولیتی کانتونی براثژلاتین باکتریولوژیکالفلوید تیو گلی کولات مدیوم
لوری سولفات براثMRS BrothMRS Agarلاکتوز براث فلویدکلینگر آیرون آگار
لایزین آیرون آگارلایزین دی کربوکسیلاز براثلیور براثلیتموس میلکلیستریا سلکتیو آگار
LB Brothلوریا برتانی براثلایزین مدیوملوانشتاین جانسون مدیوملوفلر سرم مدیوم
مالاشیت گرین براثمک کانکی براثمک کانکی آگارMR-VP Agarلیور براث
مانیتول سالت آگارمالت اکسترکت پودرمالت اکسترکت آگارمالت آگارمالونات براث
میلک آگارM17 brothM17 Agar Baseمولر هینتون براثمولر هینتون آگار
اورنج سرم آگارNNN Modified 100نوترینت براثنوترینت آگارنیترات براث
پپتون واترپپتون باکتریولوژیکالPA BrothPSE AgarOat Meal Agar
پتیتو دکستروز آگارپلیت کانت آگارPhenylanine Agarفنل رد براث بیسفنل رد آگار بیس
پروتئوز پپتونسودوموناس آگار پیسودوموناس آگار افPPLO AgarPPLO Broth
رز بنگال آگارRVS MediumEugonic LT BrothRinger Salt Solution PowderPE2 Medium
سابرود مدیوم فلوید براثاسکیم میلک آگارSS AgarSPS AgarSIM Medium
تترا تیونات براثاستارچ آگارسیمون سیترات آگارسلنیت سیستئین براثسلنیت اف براث
تریپتون سویا آگارتریپتون واترتریپتونتریپل شوگر آیرون آگارتمیتو جویس آگار
XLD Agarویولت رد بایل آگاراوره براثاوره آگارتریپتون سویا براث
پپتون واتر بافر دارراپاپورت مدیومBG AgarSPSEC Broth
اوره براثقرص رینگرمانیتول سالت آگارلایزین آیرون اگارلوریل سولفات